一、實驗原理
CCK-8（Cell Counting Kit-8），就是進行細胞計數(shù)的一種試劑盒。CCK-8實驗主要用于檢測細胞增殖、細胞毒性相關(guān)的實驗。
CCK-8試劑盒中最主要的化學(xué)藥品是WST-8，化學(xué)名為2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽。它的核心基團和MTT是一樣的，是MTT的升級版本。在電子耦合試劑（也就是細胞是活的，有呼吸，有能量代謝）存在的情況下，可被NAD+氧化還原成為水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazan)。活細胞越多，產(chǎn)生的Formazan就越多，顏色也會越深。
二、CCK8的用途
CCK-8實驗主要用于以下研究：
1. 細胞增殖
2. 藥物篩選
3. 細胞毒性測定
4. 腫瘤藥敏試驗
三、CCK8的優(yōu)點：
1. 酚紅和血清對CCK-8法的檢測不會造成干擾；
2. 細胞毒性非常低，因此加入WST-8顯色后，可以在不同時間反復(fù)用酶標儀讀數(shù)從而找到最佳測定時間。
三、實驗步驟：
1. 在96孔板中配置100μL的細胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時（37℃，5% CO2）。
2. 向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測物質(zhì)。
3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r間（例如：6、12、24或48小時）。
4. 向每孔加入10μL CCK溶液（注意不要再孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)）。
5. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。
6. 用酶標儀測定在450nm處的吸光度。
7. 若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。
注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。
計算公式：
細胞存活率 = [（實驗孔 — 空白孔）/ （對照孔 — 空白孔）] × 100%
抑制率 = [（對照孔 — 實驗孔） / （對照孔 — 空白孔）] × 100%
實驗孔 （含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測物質(zhì)）
對照孔 （含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒有待測物質(zhì)）
空白孔 （不含細胞和待測物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8）
五、注意事項
1. 第一次做實驗時，建議先做幾個孔摸索接種細胞的數(shù)量和加入 CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時間。
2. 接種時注意細胞懸液一定要混勻，以避免細胞沉淀下來，導(dǎo)致每孔中的細胞數(shù)量不一致。
3. 培養(yǎng)板周圍一圈孔培養(yǎng)液容易揮發(fā)，為減少誤差，建議培養(yǎng)板周圍的四邊每孔只加培養(yǎng)基。
4. 建議采用多通道移液器，減少平行孔間的誤差，加 CCK-8 時，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基液面下加，容易產(chǎn)生氣泡，干擾 OD 值。
5. 若細胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色或 pH 發(fā)生變化，建議更換培養(yǎng)基后再加 CCK-8，含有酚紅的培養(yǎng)基不影響測定。
6. CCK-8 反復(fù)凍融會增加背景值，干擾實驗測定。
CCK-8檢測細胞增殖
