Western Blot
蛋白免疫印跡（Western Blot）在醫學科研中應用非常廣泛，是非常基礎的分子生物學技術。Western blot是將電泳分離后的細胞或組織總蛋白質從凝膠轉移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質檢測技術，現已廣泛應用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。
實驗步驟
一、蛋白提取
1. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入PMSF,使PMSF的最終濃度為1mM.
2.去除細胞培養液，用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍（如果血清中的蛋白不干擾后續實驗，可以不洗）。以六孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用移液器反復吹打，使細胞和裂解液充分接觸。
3.將細胞裂解液轉移至1.5mL的離心管中，置于冰上放置30min,每隔10min vortex一次，使細胞裂解充分；4℃10000-14000g離心10min,取上清，即可進行后續的蛋白電泳操作。
二、BCA法測樣本中蛋白含量
取A液和B液以50:1的比例混勻，96孔板每孔加入200μl,
另用標準品做一標準曲線，濃度梯度如下：
2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625μg/ml;
每孔加入標準品或樣品20μl,37 ℃孵育30 min,酶標儀檢測樣品在562 nm波長下的吸光值并計算出相應蛋白濃度（μg/μL），乘以樣品稀釋倍數即為樣品實際濃度（單位：μg /μL），根據樣品濃度確定上樣量。
三、蛋白印記法測蛋白含量
1. 將蛋白液與5X loading buffer一起混勻后，放入100℃金屬浴5-6min.放置冰上，待上樣。
2. 準備配制SDS-PAGE分離膠。
選擇10%的分離膠按順序加各溶液，混勻好，加入兩塊制膠玻璃板中，用水封平。待下層膠凝固后，將水倒掉，吸干，開始配制濃縮膠。
按順序加各溶液，混勻好，加入兩塊制膠玻璃板中，不要有氣泡，立即將梳子插入，凝固后將梳子拔出。
做好制膠槽后，放在冰上，將電泳buffer倒入后，開始上樣，每個孔上樣40μg.記錄上樣次序。
事先配制Running buffer【tris 3.028g（25mM），Gly 14.413g（192mM），10% SDS 10mL（0.1% SDS），用ddH2O定容至1000mL】，需放在4℃預冷。
Transfer buffer 【tris 3.028g （25mM），Gly 14.413g（192mM），甲醇（Methanol） 100mL用ddH2O定容至1000mL】，需放在4℃預冷。
4. 上層膠60v,30min;下層膠100v,90min.電泳結束后需要將膠放在PBS潤洗2min,再放入轉膜緩沖液中浸泡平衡。
5. 將剪好的PVDF膜先在甲醇中浸泡5min,后在ddH2O中浸泡2min,最后在transfer buffer 中浸泡平衡15min.
6. 墊子、膜和膠的放置：紅、（+）白架子、墊子、濾紙、膜、膠、濾紙、墊子、黑架子、黑（-）。轉膜條帶是從-到+.
7. 冰上轉移，200mA恒流轉膜，根據蛋白分子量大小確定轉膜時間。轉移結束后將膜放入PBS中浸泡3-5min,剪膜。
8. 用5%脫脂牛奶（0.75g奶粉+15mL PBS）在37℃封閉1-2h.
9. 洗膜，1×PBS-T（1000mL 1×PBS+1mL Tween-20） 5-10 min,三次。
10. 孵育一抗（Hexokinase 1,1:1000稀釋；NOS3,1:200稀釋；ACSS2,1:1000稀釋；NSE/ENO2,1:1000稀釋；β-actin,43kDa,1:1000稀釋），以上抗體均用5%脫脂牛奶稀釋，4℃ 孵育過夜。
11. 從冰箱中取出膜，洗膜，1×PBST 5 min/次，6次。
12. 加二抗（鼠抗，1:5000;兔抗，1:10000），37℃，2h,搖床。
13. 洗膜，1×PBST 5 min/次，6次。
14. 化學發光顯影 （Millipore ECL system）。
15. 結果分析（Tanon, TanonImage） 記錄、拍照、掃描和保存。
結果示例
Western blot
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