實時熒光定量PCR
熒光定量 PCR（Realtime fluorescence quantitative PCR,qPCR）也稱作實時熒光定量 PCR.它是指在 PCR 反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時檢測整個 PCR 進程，最后通過標準曲線對初始模板進行定量分析的方法。該技術于 1996 年由美國 Applied Biosystems 公司推出，它的出現解決了傳統 PCR 不能對初始模板定量分析的問題。熒光定量 PCR 具有準確性高、靈敏度高、特異性強等優點，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫學研究等領域。
熒光定量 PCR 原理
在 PCR 反應體系中加入熒光基團，隨著 PCR 反應的進行，PCR 反應產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環收集一個熒光強度信號，通過熒光強度變化檢測產物量的變化，最終得到得到一條熒光擴增曲線圖，擴增曲線橫坐標表示循環數，縱坐標表示熒光強度。
圖 1:qPCR 擴增曲線圖
一般而言，熒光擴增曲線可以分為三個階段：熒光背景信號階段（基線期）、熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化；在平臺期，擴增產物已不再呈指數級的增加，PCR 的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，根據最終的 PCR 產物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數；只有在熒光信號指數擴增階段，PCR 產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系。
染料法熒光定量 PCR 是利用熒光染料與雙鏈 DNA 小溝結合發光的理化特征指示擴增產物的增加。其中以SYBR GreenⅠ最常見。
圖 2:熒光染料法原理
SYBR GreenⅠ是一種熒光染料，可與雙鏈 DNA 非特異性結合。在游離狀態下，SYBR Green Ⅰ發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈 DNA 結合，其熒光增加 1000 倍。一個反應發出的全部熒光信號與出現的雙鏈 DNA 量呈比例，且會隨擴增產物的增加而增加，可通過熒光信號的增加來記錄產物的增加。
PCR數據統計圖示例
